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TA克隆實(shí)驗(yàn)原理 

  • 發(fā)布日期:2016-09-12      瀏覽次數(shù):8266
    •     TA克隆實(shí)驗(yàn)原理
          TA克隆是利用耐熱聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校準(zhǔn)活性,即在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)3 末端加上未配對(duì)的單一A凸出尾 ,質(zhì)粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。
          TA克隆只需4個(gè)步驟:①擴(kuò)增目的PCR產(chǎn)物;②制備T克隆載體;③PCR產(chǎn)物直接克隆至T載體上④轉(zhuǎn)化并篩選重組子。
          TA克隆實(shí)驗(yàn)步驟
          (1)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與T載體的連接
          取1只無(wú)菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。
          10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
          PCR產(chǎn)物約0.3 pmol
          T載體約0.03pmol
          T4 DNA Ligase 1ul
          ddH2O 加至 25ul
          *1 DNA的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3-10倍。
          *2 相同末端的載體與DNA進(jìn)行連接時(shí),應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理,以防止其自身環(huán)化。
          (2)蓋好蓋子,用手指輕彈Ep管數(shù)次,并于臺(tái)式離心機(jī)離心2s 以集中溶液。
          (3)將反應(yīng)管放入4℃金屬浴中反應(yīng)20h。
          (4)取出約2ul的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒定連接結(jié)果,與未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA和酶切DNA一同作電泳。
          (5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使用10ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
          (6)通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。
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