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ELISA檢測6中常規(guī)樣品的處理方法

  • 發(fā)布日期:2017-02-13      瀏覽次數(shù):1630
    •    ELISA檢測6中常規(guī)樣品的處理方法
        通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,如血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等,不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的*步,下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。
        血清
        血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本,處理也比較簡單。
        用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標本,將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜,使血清析出。(將試管或離心管傾斜放置,使液面橫截面增大,能使血清更大程度的析出。)4℃ 1000×g離心20分鐘,仔細收集上清。建議將血清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
        采血過程中應(yīng)避免溶血,因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì),在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色,而導(dǎo)致檢測的不準確性。同時也應(yīng)避免細菌污染,因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。
        血漿
        用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本,標本采集后30min內(nèi)4℃ 1000×g離心15min,取上清即血漿。將上清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。
        常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等,檢測時還應(yīng)仔細閱讀試劑盒說明書,檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。
        細胞培養(yǎng)上清
        取細胞培養(yǎng)上清到離心管,1000×g離心20min,除去細胞碎片及雜質(zhì),取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
        細胞裂解液
        1)吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基,用胰酶消化細胞,加適量培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細胞可省略。
        2)收集細胞懸液,1000×g離心10min,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS潤洗3次。
        3)加入適量的預(yù)冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。
        4)將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復(fù)凍融幾次,使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎,以達到裂解的目的。
        5)4℃ 10000×g 離心10min,除去細胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
        組織勻漿液
        1)將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。
        2)將組織塊稱重,記錄后剪碎,碎塊應(yīng)盡量小,便于勻漿得更充分
        3)將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))
        4)吸取勻漿液到離心管,4℃ 5000×g 離心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
        6
        尿液、唾液等其他液體生物樣本
        1000×g離心20min,取上清即可檢測。
        總的來說,因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量,所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體,沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。
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