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淺談基因的亞克隆

  • 發(fā)布日期:2013-11-15      瀏覽次數(shù):5025
    •     亞克隆:細(xì)胞克隆中,對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)說(shuō),從原有的克隆中,再篩選出具有某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),就是subclone,分為細(xì)胞克隆和分子克隆。

      一、亞克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

      1、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理。

      2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析。

      3、掌握基因片段回收的方法。

       

      二、亞克隆實(shí)驗(yàn)原理

          細(xì)菌基因組的提?。和ㄟ^(guò)堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后,可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來(lái)。DNA溶于1mol/L的NaCl中,不溶于0.14mol/L的NaCl,而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中,通過(guò)溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開(kāi)。氯仿-異戊醇法除去蛋白,2倍體積乙醇將DNA沉淀出來(lái)。

          限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點(diǎn),處理基因組后只會(huì)得到有限的片斷。通過(guò)單酶切或者多酶切后電泳檢驗(yàn)就可以得到與物種本身有關(guān)的特定的圖譜。

          電泳后選定目的基因的條帶,紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下,使用凝膠回收試劑盒,將凝膠溶化后,通過(guò)吸附柱時(shí),核酸片段就吸附在柱上,洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇,核酸沉淀,TE溶解沉淀,核酸片段得到回收。

       

      三、試劑與器材

      1、試劑 E.coli JM109,牛肉膏,胰蛋白胨,NaCl,微量細(xì)菌基因組抽提試劑盒(上海生工),BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶(Takara),NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder),凝膠電泳回收試劑盒

      2、器材 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),水平電泳儀,漩渦混合儀,紫外檢測(cè)儀,凝膠成像分析系統(tǒng),微量移液器及吸頭。

       

      四、操作方法

      1.使用LB培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菌體。

      2.離心收集菌體,根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取基因組。

      3.限制性酶處理基因組。

      4.E.coli JM109的基因組經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶處理后,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來(lái)并對(duì)其分析。

      5.紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來(lái),使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

      6.電泳檢測(cè)回收的核酸片段。

       

      五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)

      1.菌體培養(yǎng)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌,染菌后提取得到的基因組會(huì)成多條帶,酶切的圖譜也會(huì)比較復(fù)雜。

      2.基因組提取過(guò)程中所使用的器材要嚴(yán)格滅菌,防止核酸酶降解基因組。

      3.基因組提取過(guò)程不可以劇烈振蕩,防止DNA斷鏈。

      4.在內(nèi)切酶zui適條件下充分處理基因組,得到正確的圖譜。

      5.瓊脂糖溶化要充分。

      6.切下凝膠時(shí)要注意防護(hù)紫外線(xiàn),電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來(lái),凝膠條要窄,脫尾部分不回收。

       

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