miRNA定量檢測如何達到Z佳效果

 　　miRNA定量檢測在優(yōu)化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此miRNA定量檢測使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據(jù)稱，miRNA定量檢測一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養(yǎng)的細胞。現(xiàn)存對DNA轉導原理的證據(jù)來源于內吞體和溶酶體。
 
　　對于miRNA定量檢測，可以采用 RT-PCR，實時定量PCR，和Northern Blot等方法進行檢測，通過信號強弱判斷目的基因的沉默效果。值得注意的是在進行實時定量PCR時，cDNA合成要用oligo(dT)【oligo(dT)，一種引物，cDNA合成zui常用的引物是與真核細胞miRNA定量檢測分子3'端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)】，而不是隨機引物，且預擴增片段位于靶miRNA定量檢測序列中siRNA位點的上游，由于功能的執(zhí)行者是蛋白，因此還需要對蛋白水平進行檢測，可通過Western Blot、熒光免疫檢驗法、流式細胞分析術、ELISA和表型分析等方法來檢測干擾效果。然而miRNA定量檢測zui大以及zui終的效果是細胞的代謝過程、生理生化系數(shù)等表型參數(shù)發(fā)生明顯的變化。
 
　　miRNA定量檢測一般在轉染后24小時內發(fā)生，其引發(fā)基因沉默的程度和持續(xù)時間依賴于靶蛋白質的降解率(turnover rate of the protein) 以及siRNA在細胞內的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。由于miRNA定量檢測是進入細胞后才能對蛋白的表達進行抑制，因此如何地將定量檢測轉入細胞也是成功抑制基因表達的關鍵步驟。例如，一個siRNA分子對某特定基因的抑制效率為90%，而轉染效率為10%，那么zui后抑制蛋白表達zui后的效率只有9%，可見如何提高miRNA定量檢測的轉染效率非常重要。
 
　　1、對每個基因設計并檢測兩到四個siRNA序列：為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應根據(jù)miRNA定量檢測低二級結構的區(qū)域設計。
 
　　2、選擇低GC含量的siRNA：GC含量在40～55%的siRNA比GC含量在55%以上的siRNA活性高。
 
　　3、miRNA定量檢測純化體外轉錄siRNA，在轉染前要確認siRNA的大小和純度：為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫（Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度）或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的miRNA定量檢測通常需要跑膠電泳純化【即聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）膠純化】。
 
　　通過體外轉錄的方法可以合成miRNA，這樣的成本相對化學合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選miRNA定量檢測的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到miRNA。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉染的miRNA定量檢測，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。畢竟，化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是miRNA定量檢測通過體外轉錄得到的miRNA只要較低的濃度就可以達到化學合成較高濃度得到的效果。